1.所有冻干培养基、保护剂以及容器等均需高温高压灭菌。高压灭菌前，在试管内贴上印有培养物标识的纸标签。或者，使用带无菌帽的试管。
2.取一环分离后所得到的细菌菌液或者是甘油保存的菌液，在细菌培养板上分区或者使用蛇形划板（大肠杆菌在麦康凯平板上划板），37℃倒置培养并过夜。
3.取一只干净并且进行高温高压灭菌后的试管，倒入大约10ml的细菌培养液（大肠杆菌用磅培养液），从过夜培养后的培养平板中取一个单菌落至该培养液中后，在37℃温度条件下振荡培养过夜。
4.取10支清洗干净且进行灭菌处理后的西林瓶，每个西林瓶中加入 1ml的冻干保护剂，后加入过夜培养后的1ml 菌液，盖上无菌橡胶塞，备注：需要保留出气孔，并做好标记后，存放于-80℃冰箱冷冻存储。
5.细菌冻干机预热约30分钟后，迅速将已冷冻的菌液放在细菌冻干机上，打印几小时至十几小时不等细菌已冻干。
6.冻干后关闭冻干机，取出已经冻干好的细菌，压盖密封，存储在 -80℃条件下超低温冰箱保存，可存放数年。